CRISPR质粒构建

CRISPR / Cas9技术成功进行基因编辑的关键步骤包括sgRNA的设计和构建,sgRNA决定了打靶的特异性。百奥赛图专业的技术团队精心设计和检测sgRNA,确保高特异性和高活性的进入下一步实验。

 

服务说明

sgRNA靶向物种sgRNA启动子质粒筛选标记b交付内容交付条件c可选服务d交货时间
大鼠,小鼠,人类,灵长类动物和其他哺乳动物aU6

T7

PuroR

PuroR

质粒

测序结果

质量报告

总量> 5μg

浓度> 50 ng /μL

酶切验证

Sanger测序

sgRNA效率测定10个工作日

  1. 大小鼠外其他物种的基因靶向sgRNA设计请联系我们。

  2. 如需其他抗性基因和荧光报告基因标记可按照要求提供,请咨询我们。

  3. 可根据要求提供不同数量的质粒。可提供无内毒素的maxiprep质粒。

  4. 我们提供如上所述体外sgRNA分析服务。

服务程序

1.确认sgRNA靶向基因

2.设计sgRNA并与客户确认

3.构建和检测质粒

4.运输质粒和质量报告

CRISPR活性测定

设计sgRNA后,非常关键的一步是快速准确地选择高活性sgRNA 百奥赛图开发了UCA检测方法[1],能够在体外高灵敏、便捷、快速测定sgRNA活性。UCA检测方法兼具高通量特点。 UCA检测方法基于单链退火(SSA)机制[1](图1)。


技术-UCA方法

 

图1.使用SSA机制确定CRISPR / Cas9活性的示意图。

将CRISPR / Cas9真核表达质粒(表达Cas9和sgRNA)和pUCA质粒共转染到细胞中后,Cas9-sgRNA复合物将结合并切割对应于pUCA质粒上sgRNA的靶位点。触发SSA的DNA修复机制,当萤光素酶(er)的同源互补序列形成萤光素酶的完整编码序列时,该基因将被表达。萤光素酶活性表示sgRNA活性值;荧光素酶信号越高,表明sgRNA活性越高。

现在,许多sgRNA设计工具都具有预测sgRNA活性的功能。但预测结果和实际活性之间仍然存在很大差异。必须通过实验验证sgRNA活性,以确保后续实验的成功率。

 我们的数据表明,UCA检测方法能够很好地预测sgRNA的体内活性,该方法已在高影响力期刊中引用[2,3]。通过百奥赛图UCA系统检验的高活性sgRNA有助于CRISPR / Cas9基因编辑的成功。

服务优势

1.高效,快速:从sgRNA设计到通过活性测定总计2周时间

2.灵敏,准确且接近体内活性

3.没有物种限制

[1]. Mashiko, D, et al. “Feasibility for large-scale mouse mutagenesis by injecting CRISPR/Cas plasmid into zygotes. ” Development Growth & Differentiation 56.1(2014):122.

[2]. Wu M, Wei C, Lian Z, et al. Rosa26-targeted sheep gene knock-in via CRISPR-Cas9 system[J]. Scientific reports, 2016, 6.

[3]. Lin, Zhimiao, et al. “Stabilizing mutations of KLHL24 ubiquitin ligase cause loss of keratin 14 and human skin fragility.” Nature Genetics 48.12 (2016): 1508-1516.

供体质粒构建

百奥赛图拥有10多年基因编辑课题经验,开发了数千个小鼠,大鼠和细胞系项目。可以构建用于基于ESC/EGE基因编辑的打靶载体和用于Tol2转基因的载体,提供快速的质粒设计和构建服务。

服务说明

种属可交付成果交货条件可选服务

大鼠

小鼠

细胞系

质粒

测序结果

质量报告

总量> 5μg

浓度> 50 ng /μL

酶切验证

Sanger测序

无内毒素的maxiprep质粒
原核注射及质粒抽提

服务流程

1. 确认目的基因,设计基因编辑策略;

2. 设计质粒序列,并与客户确认;

3.构建和检测质粒;

4.运输质粒和质量报告

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